|
|
Transkripční faktory CSL a jejich role v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Oravcová, Martina ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/LAG-1) působí v organismech říše Metazoa jako efektory signální dráhy Notch. V rámci této signalizace fungují jako represory nebo aktivátory transkripce genů a ovlivňují mnoho vývojových procesů. Metazoální proteiny CSL mohou regulovat expresi genů také nezávisle na Notch. Funkce proteinů CSL nezávislé na Notch by mohly být evolučně původní a pro buňku a organismus mohou být neméně důležité jako funkce dependentní na Notch. Přítomnost proteinů CSL byla zjištěna i u některých organismů říše Fungi, které postrádají komponenty signální dráhy Notch a většinu známých metazoálních interakčních partnerů proteinů CSL. Paralogy CSL poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe, cbf11 a cbf12, jsou neesenciální geny kódující proteiny lokalizované v jádře buňky. Oba se antagonistickým způsobem zapojují do regulace procesů jako například koordinace jaderného a buněčného dělení a průchodu buněčným cyklem, udržování ploidie, adhezivity buněk a dalších. V této práci jsme prokázali, že oba paralogy CSL mají schopnost sekvenčně specificky vázat kanonický CSL-responzivní element DNA in vitro a Cbf11 také in vivo. Oba proteiny mohou aktivovat genovou expresi in vivo, a vykonávat tak funkci transkripčních faktorů. Pomocí metody ChIP-chip jsme analyzovali vazbu...
|
|
|
Transkripční faktory CSL a jejich role v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Oravcová, Martina
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/LAG-1) působí v organismech říše Metazoa jako efektory signální dráhy Notch. V rámci této signalizace fungují jako represory nebo aktivátory transkripce genů a ovlivňují mnoho vývojových procesů. Metazoální proteiny CSL mohou regulovat expresi genů také nezávisle na Notch. Funkce proteinů CSL nezávislé na Notch by mohly být evolučně původní a pro buňku a organismus mohou být neméně důležité jako funkce dependentní na Notch. Přítomnost proteinů CSL byla zjištěna i u některých organismů říše Fungi, které postrádají komponenty signální dráhy Notch a většinu známých metazoálních interakčních partnerů proteinů CSL. Paralogy CSL poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe, cbf11 a cbf12, jsou neesenciální geny kódující proteiny lokalizované v jádře buňky. Oba se antagonistickým způsobem zapojují do regulace procesů jako například koordinace jaderného a buněčného dělení a průchodu buněčným cyklem, udržování ploidie, adhezivity buněk a dalších. V této práci jsme prokázali, že oba paralogy CSL mají schopnost sekvenčně specificky vázat kanonický CSL-responzivní element DNA in vitro a Cbf11 také in vivo. Oba proteiny mohou aktivovat genovou expresi in vivo, a vykonávat tak funkci transkripčních faktorů. Pomocí metody ChIP-chip jsme analyzovali vazbu...
|
|
|
Charakterizace vazby transkripčních faktorů CSL na DNA v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Jordáková, Anna ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Proteiny Cbf11 a Cbf12, patřící do rodiny transkripčních faktorů CSL, jsou u poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe zapojeny v široké škále buněčných procesů - mj. regulují buněčnou adhezi a podílejí se na udržování integrity genomu. V rámci celého genomu jsme již dříve identifikovali cílové lokusy, kam se proteiny CSL váží in vivo. Mnoho z cílových míst neobsahuje konsenzuální CSL-vazebný element. Patrně existují různé režimy vazby proteinů Cbf11/12 na DNA a doposud nebylo známo, s jakou biologickou funkcí je způsob vazby na DNA spojen. Pro účely studia DNA-vazebných módů proteinů CSL jsme v rámci tohoto projektu pracovali na zavedení DNA-vazebné mutace (DBM), která způsobuje ztrátu schopnosti proteinů CSL se vázat na kanonický motiv in vitro, do chromozomálního lokusu genů cbf11 a cbf12. S použitím "ura4 selekčního systému" jsme úspěšně zkonstruovali kmeny Cbf12-TAP a Cbf12DBM-TAP, tj. kmeny bez/s DBM v otevřeném čtecím rámci Cbf12, ve kterých je navíc protein Cbf12 C-terminálně značen TAP-tagem a obsahuje intaktní oblast 3'UTR. Nově jsme v naší laboratoři zavedli CRISPR/Cas9 systém, s využitím kterého se nám podařilo připravit kmen Cbf11-TAP. S konstrukcí kmene Cbf11DBM-TAP jsme prozatím neuspěli, nicméně v rámci práce diskutujeme možné optimalizace konstrukčního postupu, které by mohly vést...
|
|
|
Transkripční faktory CSL a jejich role v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Oravcová, Martina ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Heidingsfeld, Olga (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/LAG-1) působí v organismech říše Metazoa jako efektory signální dráhy Notch. V rámci této signalizace fungují jako represory nebo aktivátory transkripce genů a ovlivňují mnoho vývojových procesů. Metazoální proteiny CSL mohou regulovat expresi genů také nezávisle na Notch. Funkce proteinů CSL nezávislé na Notch by mohly být evolučně původní a pro buňku a organismus mohou být neméně důležité jako funkce dependentní na Notch. Přítomnost proteinů CSL byla zjištěna i u některých organismů říše Fungi, které postrádají komponenty signální dráhy Notch a většinu známých metazoálních interakčních partnerů proteinů CSL. Paralogy CSL poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe, cbf11 a cbf12, jsou neesenciální geny kódující proteiny lokalizované v jádře buňky. Oba se antagonistickým způsobem zapojují do regulace procesů jako například koordinace jaderného a buněčného dělení a průchodu buněčným cyklem, udržování ploidie, adhezivity buněk a dalších. V této práci jsme prokázali, že oba paralogy CSL mají schopnost sekvenčně specificky vázat kanonický CSL-responzivní element DNA in vitro a Cbf11 také in vivo. Oba proteiny mohou aktivovat genovou expresi in vivo, a vykonávat tak funkci transkripčních faktorů. Pomocí metody ChIP-chip jsme analyzovali vazbu...
|
|
|
Transkripční faktory CSL a jejich role v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Oravcová, Martina
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/LAG-1) působí v organismech říše Metazoa jako efektory signální dráhy Notch. V rámci této signalizace fungují jako represory nebo aktivátory transkripce genů a ovlivňují mnoho vývojových procesů. Metazoální proteiny CSL mohou regulovat expresi genů také nezávisle na Notch. Funkce proteinů CSL nezávislé na Notch by mohly být evolučně původní a pro buňku a organismus mohou být neméně důležité jako funkce dependentní na Notch. Přítomnost proteinů CSL byla zjištěna i u některých organismů říše Fungi, které postrádají komponenty signální dráhy Notch a většinu známých metazoálních interakčních partnerů proteinů CSL. Paralogy CSL poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe, cbf11 a cbf12, jsou neesenciální geny kódující proteiny lokalizované v jádře buňky. Oba se antagonistickým způsobem zapojují do regulace procesů jako například koordinace jaderného a buněčného dělení a průchodu buněčným cyklem, udržování ploidie, adhezivity buněk a dalších. V této práci jsme prokázali, že oba paralogy CSL mají schopnost sekvenčně specificky vázat kanonický CSL-responzivní element DNA in vitro a Cbf11 také in vivo. Oba proteiny mohou aktivovat genovou expresi in vivo, a vykonávat tak funkci transkripčních faktorů. Pomocí metody ChIP-chip jsme analyzovali vazbu...
|
|
|
The role of CSL proteins in oxidative stress response of Schizosaccharomyces pombe
Tvarůžková, Jarmila ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Rallis, Charalampos (oponent)
Oxidativní stres představuje komplexní a intenzivně studovaný fenomén, který je úzce spjat s řadou lidských onemocnění a procesem stárnutí u široké škály organizmů. V nedávné době bylo popsáno velké množství klíčových buněčných regulátorů včetně signální dráhy Notch jako proteinů reagujících na redoxní stav buňky. V této práci jsme popsali roli proteinů CSL (CBF1/Su(H)/LAG-1), efektorů signální dráhy Notch u živočichů, v odpovědi na oxidativní stres u kvasinky Schizosaccharomyces pombe. S. pombe obsahuje dva paralogy proteinů CSL, Cbf11 a Cbf12, které fungují antagonisticky při regulaci buněčného cyklu a adheze. Oba proteiny jsou schopny vázat kanonický CSL element a aktivovat transkripci, takže fungují jako pravé transkripční faktory CSL. Zjistili jsme, že kmen postrádající gen cbf11 je rezistentní vůči peroxidu vodíku ale ne vůči menadionu, zdroji superoxid anion radikálu. Analýzou genetických interakcí u dvojitých deletantů jsme odhalili, že rezistence mutanta Δcbf11 je závislá na přítomnosti antioxidačních enzymů katalázy a sulfiredoxinu. Geny kódující tyto enzymy jsou pod transkripční kontrolou signální dráhy MAP kinázy Sty1 a transkripčního faktoru Pap1, které jsou také nezbytné pro rezistenci buněk Δcbf11. Cbf12 pravdepodobně hraje pouze minoritní roli v odpovědi na oxidativní stres, nicméně...
|
|
|
Příprava a testování polyklonálních protilátek proti Cbf11 a Cbf12, transkripčním faktorům rodiny CSL kvasinek Schizosaccharomyces pombe
Tvarůžková, Jarmila ; Půta, František (vedoucí práce) ; Moserová, Michaela (oponent)
Proteiny rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ, Suppressor of Hairless, Lag-1) jsou transkripční faktory s klíčovou rolí ve vývoji metazoálních organismů, kdy působí nejen jako součást dráhy Notch, ale i nezávisle na této dráze. Homology proteinů CSL byly identifikovány i v houbových organismech postrádajících signální dráhu Notch. Proteiny Cbf11 a Cbf12 jsou antagonistické paralogy důležité pro koordinaci buněčného a jaderného dělení, regulaci buněčné adhese a integritu chromosomů v jednobuněčné kvasince Schizosaccharomyces pombe. Rovnováha v aktivitě proteinů Cbf11 a Cbf12 je klíčová pro jejich správnou funkci a doposud připravené chromosomálně značené alely těchto proteinů vykazují chování v různé míře odlišné od divokého typu. Dostupnost specifických protilátek by tedy výrazně usnadnila studium biologické funkce proteinů CSL v kvasince S. pombe. V předkládané bakalářské práci je prezentován návrh a příprava imunogenu a testování protilátek proti proteinům CSL získaných z komerčního zdroje. Pomocí bioinformatických nástrojů byly vybrány vhodné imunogenní fragmenty proteinů Cbf11 a Cbf12 a korespondující sekvence DNA byly klonovány do expresního plasmidu. Exprese solubilních proteinů značených hexahistidinem na N-konci byla optimalisována a nativní protein byl purifikován pomocí afinitní (chelatační)...
|
|
|
DNA vazebné vlastnosti proteinů rodiny CSL ve Schizosaccharomyces pombe
Ptáčková, Martina ; Půta, František (vedoucí práce) ; Doležal, Pavel (oponent)
Transkripční faktory rodiny CSL (CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/Lag-1) jsou jako výkonná složka signální kaskády Notch podstatné pro mnohé vývojové procesy metazoálních organismů, ale mohou působit také nezávisle na Notch. V nedávné době byla jejich přítomnost prokázána v houbových organismech, které postrádají signalizaci Notch a také většinu známých metazoálních interakčních partnerů. Proteiny CSL jednobuněčné kvasinky Schizosaccharomyces pombe, Cbf11 a Cbf12, byly experimentálně určeny jako neesenciální jaderné transkripční faktory, které antagonistickým způsobem regulují buněčnou adhezi, produkci extracelulárního materiálu, morfologii kolonií, septaci a oddělování dceřiných buněk, koordinaci jaderného a buněčného dělení a udržování ploidie. Responzivní geny těchto faktorů dosud nejsou známé. V této práci byly predikovány geny S. pombe, jejichž promotorové oblasti představují možné přímé cíle pro vazbu proteinů Cbf. Vazba proteinů Cbf11, Cbf12 a také zkráceniny Cbf12∆N na vazebné elementy pro faktory CSL obsažené v regulačních oblastech vybraných genů S. pombe byla testována in vitro metodou EMSA a následně v případě proteinu Cbf11 in vivo metodou ChIP. Proteiny Cbf11 a Cbf12∆N sekvenčně specificky rozpoznávají vazebné elementy in vitro, ale jejich afinita, stejně tak jako jejich vazebné...
|
host ::
RSS.